第五节　SDS-PAGE蛋白电泳

SDS-PAGE 由非变性 PAGE 发展而来，是由丙烯酰胺（Acr）和亚甲基双丙烯酰胺（Bis）在催化剂的作用下聚合交联而成，具有三维网状结构，其分离机制包括电荷效应、浓缩效应和分子筛效应。SDS-PAGE 作为生化研究中常用的蛋白质分析手段，具有装置简单、条件灵活、方法成熟和重复性良好的多种优点，具体表现为以下几点：①在蛋白组提取方面，通过使用表面活性剂SDS，能提高样品中难溶性蛋白质组分的溶解、提取和电泳分离；②在蛋白质鉴定方面，使用SDS-PAGE时，样品进行变性处理后，解离为单独的多肽链，便于进一步测序的鉴定；③在蛋白质定性方面，通SDS-PAGE电泳时，多肽链分子量与其电泳距离或淌度成正比，可以估算其分子量，起到粗略定性的作用。由此，Breci等人将SDS-PAGE分离切胶作为质谱检测分析前的一种样品分离分级的方法，并探究了该方法的效率。

到目前为止，在多肽链层面的分离上仍然是分辨率最高的方法，且具有装置简单、条件灵活、方法成熟和重复性良好的多种优点。使得SDS-PAGE成为自1960年起几乎所有生化研究中必备和常用的蛋白质分析手段。对于SDS-PAGE分离后的蛋白质的检测，近30年来多采用免疫化学染色（Western blot）或染料染色接以条带选取和质谱分析，但是充分利用SDS-PAGE在复杂蛋白质体系多肽链层面上的分离优势、不依赖于染色结果，系统性地与质谱进行联合应用，实现大规模组学分析的研究还很少。

一般SDS-PAGE蛋白电泳的分析流程包括制胶→上样→电泳→染色→成像。

1.制胶

制备聚丙烯酰胺凝胶，其中浓缩胶浓度固定为 5%，分离胶浓度一般为 12%和 15%，配方见表2-5-1。

2.上样及电泳

一般取供试品溶液10μl及预染色的蛋白Marker 5μl上样，以80V恒压预电泳 30 分钟，当溴酚蓝指示剂到达分离胶以后，采用 110V 恒定电压继续进行电泳约120分钟，直至溴酚蓝指示剂距离凝胶底部约 0.5cm 处时，关闭电源。

3.染色及成像

小心将PAGE胶从玻璃板间剥离，将剥离的凝胶置于10ml染色液［0.1% 考马斯亮蓝 R250（w/v）-7% 醋酸（v/v）-50% 甲醇（v/v）］中，于水平往复式摇床上（60rpm/min）染色15分钟。弃去染色液，换上10ml脱色液［7%醋酸（v/v）-20%甲醇（v/v）］，60rpm/min，脱色30分钟后，更换新的脱色液，继续脱色90分钟。弃去脱色液，加入15ml水合液［7%醋酸（v/v）］，使凝胶水合30分钟以上。水合结束后，用洁净的医用卫生棉小心擦去凝胶表面沉积的CBB颗粒。最终将处理好的PAGE胶密封在适量的7% 醋酸溶液（v/v）当中，拍照及扫描。

将上述电泳的结果进行差异化比对，对于差异区进行切胶和酶解，供进一步质谱分析和鉴定。