第二节　感染性皮肤病的病原体鉴定

皮肤是人体最大的防御器官，其覆盖在人体表面，与黏膜共同形成人体的第一道防线。其长期接触多种微生物，是多种细菌、真菌和病毒栖息地，因此构成了一个复杂生态系统。尽管皮肤中的微生物绝大多数无害，甚至有益，但在某些特定条件下，某些微生物已与诸如痤疮、银屑病和湿疹等皮肤病相关联。另外，一些新的感染性病原体持续不断的出现，而原来一些已知的病原体由于抗生素的大量使用而产生广泛耐药，这些均对皮肤感染性疾病的诊断技术提出了更高的要求。本节我们将就现有的感染性皮肤病的实验室检测技术以及研究进展进行简要的介绍。

一、各分子生物学技术在皮肤病相关病原体鉴定中的应用

（一）以PCR为基础的检测技术在真菌感染中的应用

以往真菌感染的诊断往往依赖于菌落的形态学检查，即通过直接镜检以及生理生化实验对体外培养的真菌进行综合判断。然而由于此类方法易受培养条件以及人为因素的影响，且皮肤癣菌的菌落本身也易发生变异，因此常常不能反映准确的真菌特征。近年来，随着免疫学和分子生物学的发展，多种生物检测技术被不断应用于真菌菌种鉴定，这些技术克服了表型分型的不足，加快了感染菌种的鉴定，更加便于疾病的诊治。

随机扩增多态性DNA（randomly amplified polymorphic DNA，RAPD）是一种利用随机引物对目的基因组DNA进行PCR扩增，产物经电泳分离后通过毛细管电泳测序，分辨DNA分子的序列信息。该方法不需要了解对象基因组的任何序列信息，也无需设计引物，操作简便，能够客观反映真菌间的DNA差异。目前以此为研究方法对致病菌种进行分子分型已有较多报道，如皮肤癣菌、念珠菌等。研究应用RAPD方法对暗色真菌、曲霉等菌种进行分类鉴定及种内分型可获得较为详尽的遗传学资料，敏感性较高，但是重复性相对较差。因此一般采用多种随机引物进行PCR扩增并联合应用其他检测方法。

限制性片段长度多态性分析（restriction fragment length polymorphism，RFLP）是一种利用一种或几种限制性内切酶消化来自不同菌种基因组的DNA片段，通过消化片段的不同来鉴别菌种的方法。其也可用于真菌的分型研究和临床分离菌株的鉴定。目前应用于检测真菌种属的基因很多，包括DNA拓扑异构酶Ⅱ、18S核糖体RNA、核糖体RNA的转录间区（ITS区）以及线粒体DNA等。曾有学者采用4种限制性内切酶（BsYiI、DdeI、HinfI和MvaI）比较12株皮肤癣菌的ITS区，结果除了红色毛癣菌和T.raubitshekii表现出酶切图谱相同外，其他任意一株的酶切图谱均可将其与其余菌种进行区分。北京大学医学部真菌和真菌病研究中心采用HinFI、MspI、BsuRI和RsaI四种外切酶组合对致病性外瓶霉ITS区进行检测，可以在分子水平上鉴定常见的7种致病菌，给外瓶霉菌种鉴定提供了便捷的方法。由于RFLP有极好的分辨能力，所以在解决一些流行病学问题以及分裂鉴定时很有用途，目前已从单纯的实验室研究转向临床应用。除此之外，随着基因测序技术的不断完善，当遇到某些真菌菌种无法用经典限制性片段长度多态性分析法有效区分时，研究者还可以通过PCR产物的直接测序来确认该病原体的种类，将两者结合起来，大大提高了真菌的检测效率。

（二）激光捕获显微切割技术在感染性皮肤病中的应用

激光捕获显微切割（laser capture microdissection，LCM）是近些年来出现并已日趋成熟的一项新技术。众所周知，DNA芯片和高通量测序等高通量平行检测方法在基因组水平和转录水平为研究生理和病理过程中所发生的分子事件带来了突破性的进展。然而，由于生物组织器官的异质性，对混合细胞的研究往往并不能真正反映细胞的生物过程，因此迫切需要一项技术能从混合细胞中提取单一的细胞作为研究材料，从而提高研究结果的客观性和可重复性。有些研究者曾以体外纯化培养的细胞作为研究材料。虽然从表面上看这种纯化的细胞能达到研究要求，但由于细胞建株的永生化过程，使细胞不论是细胞表型、生物学行为还是基因表达产物均与原代细胞相比发生了显著的变化，因此并不能真正代表生理或病理状态下的细胞状态。LCM技术的出现使这些问题得到了较好的解决。和其他从组织中获取细胞的方法相比，LCM技术具有省时、准确、不造成细胞损伤且易于掌握等特点。目前，该技术已广泛应用于肿瘤学、细胞发生学等多个学科。

在肿瘤方面，美国国立癌症研究所提出的癌基因组解剖计划，需要对细胞的正常、癌前及癌变三个不同阶段的癌基因表达进行比较。这就要求研究者需要通过细胞形态学以及活细胞免疫组织化学证明所检测的细胞处在相应的生理或病理阶段。LCM技术则可以作为这项计划研究的有力工具，使研究者方便地得到生物体材料中特定的目的细胞。利用LCM技术，捕获来自不同时空组织的细胞，对其进行基因表达模式分析，可为研究多种疾病的发生、发展提供重要的信息。在皮肤鳞状细胞癌，以往研究由于皮肤癌细胞中通常混有肿瘤细胞和肿瘤相关的炎症细胞，再加上皮肤内还存在角质形成细胞和皮肤细胞，这些均使肿瘤DNA被非肿瘤细胞所稀释。Moussai等人结合LCM技术，切割分离组织标本中的肿瘤细胞和非肿瘤炎症细胞，发现血管内皮生长因子在皮肤鳞状细胞癌肿瘤微环境形成过程中至关重要。

在感染性疾病方面，无论是病毒、细菌还是真菌，LCM技术都有非常广泛的应用。其可以有目的的选取被感染的细胞进行检测，大大提高了病原体的检验效率。在病毒感染方面，有研究采用LCM-PCR技术，检测SCSC中人乳头瘤病毒（HPV）的感染，结果在3例疣状和基底细胞样SCSC中均检测到HPV感染。该结果进一步支持HPV感染是SCSC的危险因素，特别是对于疣状和基底细胞样SCSC。在细菌感染方面，Selva等对比LCM与常规方法提取蜡块组织DNA（需要十张以上的组织切片），在结核杆菌检测中发现两者结果高度一致。由此，作者认为，LCM-PCR是一种检测石蜡包埋组织中结核杆菌的好方法。最后，在真菌感染方面，有学者通过Blankophor染色对5例侵袭性真菌感染的肺组织冰冻标本进行研究，用LCM技术切取单个菌丝。其后通过ITS区的测序发现60%～90%的标本可以检测到烟曲霉。该结果与标本的直接真菌培养法基本一致。

（三）高通量测序技术在感染性皮肤病中的应用

如前所述，新一代测序技术（NGS）的出现是对传统基因检测技术一次革命性改变。它的出现不仅推动遗传病检测技术的飞速发展，而且还使很多以前疑难的检测领域有了新的解决方法，如微生物种属检测、肿瘤的分子诊断等。本节最后，我们将对高通量测序技术在感染性皮肤病中的应用做一些简要的介绍。

细菌16S基因是细菌染色体上编码16S rRNA的DNA序列，它是由可变区与保守区交错排列而成。保守区在各种细菌中基本保持不变，而可变区则会因不同细菌和不同种属而不同。因此，该特点提示我们可以利用保守区设计通用引物扩增细菌的可变区DNA序列，再利用可变区的差异来鉴别菌种。通常情况下5S rRNA虽然易分析，但核苷酸少，没有足够的遗传信息用于分类研究；而23S rRNA序列长度较长，分析较困难，故目前多数研究仍以16S rRNA序列作为主要研究对象。以往16S rDNA基因序列的检测主要通过PCR产物的克隆测序、探针杂交以及限制性片段长度多态性分析（RFLP）等。这些方法耗时较长，通量较低，无法大规模对所检测菌落的组成进行高通量的分析。

随着二代测序技术的蓬勃兴起，人们意识到利用此技术可以有效解决技术上的瓶颈，一系列颇具影响力的成果于这时期发表，其中包括人类微生物组计划（Human Microbiome Project）。该计划选取129名健康男性和113名健康女性，分别在男性的15个身体部位和女性的18个身体部位采集微生物样本，利用罗氏公司的454高通量测序仪检测16S rRNA的V3～V5区的序列变化，发现微生物菌落在人体不同部位以及相同部位的不同个体间均存在明显差异。而这种差异并不受外部影响因素的干扰，如经常接触其他人、衣服和环境等，在一段时间内会保持相对的稳定。因此，也就是说每个人并没有从环境中获得流行的微生物，而是保持各自独特的微生物特征。除此之外，有学者通过16S检测还发现一些皮肤部位比其他部位含有更多差异的微生物菌落。比如高度暴露在外的干燥部位（如手掌）在一段时候表现出显著的稳定性。而相反，在一些高度湿润的部位，比如脚部，其稳定性最差，易受个人卫生和接触环境等多因素的影响。

除此之外，宏基因组学（metagenomics）也是新一代高通量测序技术在皮肤微生物检测中的一项重要应用。宏基因组又称环境基因组学，是指不依赖培养直接从微生物的天然环境中提取微生物基因的遗传物质，对微生物群体进行研究分析的方法。其以微生物的群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和测序分析为研究手段，以微生物的多样性、种群结构、进化关系、功能活性为研究目的。目前已在人体多种疾病中取得重大研究成果，如肠道微生物构成和数量的失衡与肥胖、2型糖尿病以及肠道炎症等相关；口腔菌群与龋齿、牙周炎密切相关；鼻咽部菌群改变与急性中耳炎、鼻窦炎、上呼吸道感染等密切相关等。

目前与皮肤病有关的宏基因组研究主要关注皮肤微生物菌群以及肠道微生物菌群。正常皮肤表面生活着大量的细菌、真菌、病毒、衣原体和原虫。不同皮肤部位细菌和真菌的分布特点不同，细菌多分布在手部，而真菌则主要集中在足部。目前根据这些菌群的定植特点，可以分为常驻菌群和暂住菌群。常驻菌群是指长期定居在皮肤表面可以自我恢复的菌群，包括葡萄球菌、棒状杆菌、丙酸杆菌、不动杆菌等。暂住菌群指通过接触，从外界环境中获得的一类菌群。常驻菌群在自身免疫力低下等条件下可以转化为致病菌群，而一些外部或者内部因素的影响也可以导致皮肤菌群失调，从而造成皮肤疾病的发生。

特应性皮炎（atopic dermatitis，AD）是由遗传易感性、食物过敏刺激、吸入过敏原或者感染而造成的皮肤炎症反应。以往宏基因组学研究显示，将AD患者发病时的皮肤样本与发病前或者治疗后相比较，葡萄球菌所占比例明显增加，由原来的35%增到90%。而随着治疗，皮肤中链球菌、丙酸杆菌、棒状杆菌的数目逐渐增加，从而提示AD的发病与皮肤菌群多样性降低以及金黄色葡萄球菌引起的超敏反应有关。

其次在银屑病（psoriasis）研究方面，有研究采用宏基因组学方法比较6例银屑病患者皮损处与正常皮肤菌群的变化，发现在皮损处最主要的优势菌群为硬壁菌门，其含量比正常皮肤和健康人皮肤都明显增高。而与此相反，该研究还发现正常皮肤常见的放线菌和丙酸杆菌在皮损部位明显降低。该结果首次确定了银屑病皮损处的菌群结构不同于健康人皮肤，使人们对银屑病的病因有了更深的认识。Fahlen等人比较了10例银屑病患者和12例正常对照的皮肤菌群构成，结果提示银屑病患者皮损处变形菌的比例较健康人皮肤明显增加，而葡萄球菌和丙酸杆菌含量则显著低于健康人群皮肤。

最后在头皮屑研究领域，以往认为头皮屑与脂溢性皮炎是属于同一疾病谱的疾病。头皮的微生物群主要是由细菌和真菌等组成的，主要包括葡萄球菌、丙酸杆菌和马拉色菌。在这之中，马拉色菌感染被认为是导致头皮屑的重要因素。而最近法国学者Clavaud等利用宏基因组学技术发现头皮屑患者头皮菌落中限制马拉色菌和表皮葡萄球菌数目明显增加，而痤疮丙酸杆菌却明显减少。该结果纠正了我们以往对头皮屑致病因素的认识，首次表明其发生与头皮表面的微生物菌群失衡有关。

二、总结与展望

综上所述，现代分子生物学技术的应用丰富了临床对皮肤病病原体的鉴定方法，对于判断病原体的来源，治疗后的复发和再感染，了解病原体在不同地理环境中的分布，以及诊断、预防和治疗都具有重要意义。尽管这些技术在皮肤微生物菌落研究中取得一些成就，但由于目前菌群之间的相互作用机制还不清楚，且病原体遗传背景的不同也会引起疾病表型发生很大改变，因此这些都限制我们的研究成果在皮肤病的诊断、治疗和预后中的应用。现有的研究成果只是开端，未来在感染性皮肤病领域还有很多研究值的更加深入探索。