第三节　皮肤肿瘤的诊断与治疗

肿瘤是机体在多种致癌因素作用下，局部组织的某些细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控，导致其克隆异常增生而形成新的赘生物。其多发人体肺脏、肝脏、肾脏、脑等实质器官。皮肤由于长期接触各种理化因素刺激或者病毒感染，也是肿瘤的好发部位。临床上根据皮肤肿瘤的病理类型分为良性肿瘤和恶性肿瘤。目前皮肤良性肿瘤主要包括脂溢性角化症、色素痣、血管瘤等。而恶性肿瘤则包括基底细胞癌、鳞状细胞癌、恶性黑素瘤及帕哲病等。除此之外，由机体血液系统T淋巴细胞归巢至皮肤而形成的皮肤T细胞淋巴瘤也是皮肤科常见的肿瘤，主要包括蕈样肉芽肿。

肿瘤的发生是一个多阶段、多通路、多基因的复杂过程。如何揭示基因和通路的潜在作用，就成为研究和治疗肿瘤的重要课题。而20世纪70年代，随着分子生物学的蓬勃兴起，研究者们运用了大量分子生物学技术研究肿瘤相关基因及其表达产物在肿瘤发生发展中的作用。截至目前已取得了很多举世瞩目的成果，尤其在皮肤肿瘤领域。因此本节我们简要介绍一些分子生物学技术在肿瘤的预防、诊断和治疗中的作用。

一、皮肤肿瘤的分子诊断及常见检测技术

（一）皮肤肿瘤的相关基因突变检测

如前所述，在癌症发生过程中常伴有细胞遗传物质的改变，因此对突变基因的检测将有利于皮肤肿瘤的分子诊断。在这方面，新一代测序技术无疑具有无可比拟的优点。截至目前，已有多个基因突变与皮肤肿瘤的关系被临床研究所证实。BRAF突变是黑素瘤中最常见的突变，约50%的病例均携带有该变异，其中80%～90%的BRAF突变位于第600位密码子，使原有的缬氨酸被谷氨酸取代。已有研究证实这一替代可以导致MARK/ERK通路激活，从而促使肿瘤细胞增殖。其次，KIT基因编码一种跨膜糖蛋白，分布于细胞表面，其与相应配体SCF结合形成二聚体，可以激活酪氨酸激酶途径，从而调控基因表达、细胞生长和增殖。已有研究发现约23%的慢性日光皮损相关的黑素瘤患者均具有KIT的基因突变，其常见突变位点位于11号外显子的L576P和13号外显子的K642E。除此之外，RAS家族成员（NRAS、KRAS、HRAS）也是黑素瘤的突变高发基因，约有20%、2%和1%的黑素瘤病例存在以上基因的突变。

除了上述黑素瘤的常见基因突变，近几年，随着新一代测序技术（NGS）的广泛应用，探索新的致病基因，发现新的致病位点，也成为黑素瘤的新的研究热点。Nikolaev等人通过基因外显子测序对7例黑素瘤的基因编码区进行检测，发现除BRAF、NRAS等常见突变外，在两例未检测到BRAF的病例中存在MAP2K1和MAP2K2基因突变（图5-2）。进一步扩大样本，作者发现该基因突变率约占8%，可以导致持续性的ERK磷酸化和MEK抑制剂的抵抗。同年，Krauthammer等通过外显子捕获检测147例黑素瘤患者，发现PPP6C和RAC1基因突变与日光暴露性黑素瘤高度相关，突变率约占总病例数的12%和9.2%，仅次于BRAF和NRAS。进一步功能研究也证实RAC1的P29S基因突变可以促进Rac1与下游效应蛋白的结合，从而促进黑素瘤的增生和转移。

在皮肤T细胞淋巴瘤（cutaneous T-cell lymphoma，CTCL），新一代测序技术在蕈样肉芽肿遗传背景的研究方面也取得不少的成就。Almeida等人采用外显子测序技术检测25例Sézary综合征和17例CTCL病例，发现在CTCL患病组织或者CTCL转移白细胞内，存在TET2、CREBBP、MLL2、MLL3、BRD9等多个与T淋巴细胞白血病有关的致病基因突变，从而提示相似的组织器官可能具有相似的癌症疾病谱和致癌机制。除此之外，该研究还首次证实CTCL细胞内存在MAPK1、BRAF、CARD11和PRKG1的遗传变异，这些变异可以促进MAPK、NFAT等多个通路的活化。当然，也有一些研究发出不同的声音，有研究发现不同的研究方案、病例类型，会对肿瘤细胞突变的分析产生影响。早期蕈样肉芽肿没有相关的可重复性的特异性异常改变，而疾病晚期则有较多特异性改变。如：癌基因p16和p53在疾病早期未发生改变，但常在疾病晚期（肿瘤期）发生突变。

（二）皮肤肿瘤相关的染色体异常检测

DNA的拷贝数变化（copy number variants，CNVs）是肿瘤遗传变异最常见的一种。比较基因组杂交是扫描全基因组拷贝数变化非常好的方法。在进行染色体比较基因组杂交时，从肿瘤和正常对照细胞中分离出基因组DNA，分别标记不同的荧光染料，与分裂中期的染色体进行杂交。20世纪70年代，随着荧光标记技术的发展，研究者首次将染色体显带技术和染色体原位杂交联合，使用荧光素标记的探针，将探针和分裂中期的染色体或者分裂间期的染色质进行杂交，形成了新的荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization，FISH）。该技术具有安全、快速、灵敏度高、探针能长时间保存等优点，一经推出就被广泛应用于肿瘤等多种疾病的染色体结构检测。

在疑难黑素瘤的诊断中，FISH技术发挥了越来越重要的作用。其可以在极短的时间内明确鉴别黑素细胞的良恶性质，现已成为判别恶性黑素瘤最准确客观的方法。目前临床上应用FISH筛查恶性黑素瘤多采用第6号染色体上的三个基因靶点6p25/RREB1、6q23/MYB和第6号染色体的着丝粒，以及第11号染色体11q13（CCND1）的靶点组合。有研究报道该FISH的阳性预测值大约为62.5%，而阴性预测值为80.7%。该结果提示应用FISH鉴别恶性黑素瘤时一定要结合组织形态，两者结合可提高黑素瘤诊断的准确性。最后，对染色体异常的检测还有助于肿瘤的病理分型和治疗方案的筛选。如6p常见于30%的恶性黑素瘤，常预示预后较差。9p的丢失常和遗传性黑素瘤综合征相关，该染色体异常多提示预后较好。

（三）皮肤肿瘤组织中基因表达调控异常的检测

肿瘤组织癌变过程中常伴有突变的累积，而这种累积会改变正常细胞的理化性质，使细胞内的癌基因与抑癌基因发生表达改变，从而促使正常细胞恶性转化。自20世纪70年代，采用分子生物学的技术手段，平行观察肿瘤组织和相应的正常组织的基因表达差异，就成为肿瘤致癌机制检测和早期生物标记物筛查的重要技术手段。目前根据检测主体的不同，可将这些检测方法分为两类，即针对转录水平的检测和针对蛋白水平的检测。在转录水平，如果要检测整个基因表达谱，可以做基因表达谱芯片；而如果针对某几个基因，则可以用RT-qPCR。在蛋白水平，蛋白质芯片或者二维电泳被认为是检测整个蛋白表达谱的合适方法；而如果针对某几个蛋白的检测，可以做免疫印迹分析或者免疫组织化学。以往根据分子生物学的中心法则，蛋白质是由mRNA经过转录后翻译而产生的，因此人们一直认为mRNA和蛋白质的表达模式应该是近似的。然而近几年，随着人们对转录后修饰过程的认识以及多项研究成果，研究者们发现大多数RNA的表达差异与对应的蛋白质丰度变化毫无关系。究其原因，一方面是由于蛋白质表达时间往往滞后mRNA的表达时间，即两者时间变化曲线不同；另一方面可能存在其他调控因素，如miRNA等转录后的调控、mRNA的降解速度、修饰折叠等。因此，研究者需要根据自身实验目的，选择不同实验方法。

目前针对皮肤肿瘤的异常表达基因以及潜在的生物标记物，已有一些相关报道。黑素瘤活性抑制蛋白（melanoma inhibitory activity，MIA）是1989年Bogdahn等在研究恶性黑素瘤细胞株时分离得到的一种新的黏附调节蛋白。其基因位于染色体19q13，被证实可以通过自分泌方式抑制肿瘤细胞的生长。以往基因表达谱的研究发现该基因特异性表达于黑素瘤细胞，抑制肿瘤细胞与纤维连接蛋白黏附，调节细胞从细胞外基质脱落，从而影响肿瘤细胞转移。而最新的研究也证实该蛋白存在于黑色素瘤患者血浆的外泌体中，可以作为黑素瘤判断预后的生物标志物。具有类似作用的还有S100B。S100B蛋白是S100钙结合蛋白家族重要的成员，其可以结合Ca2+，与肿瘤细胞内多种蛋白质发生相互作用，在肿瘤细胞的增殖、分化，转移等过程中均发挥重要作用。其在恶性黑素瘤细胞中特异性表达，可以作为生物标记物协助黑素瘤的预后、疗效和复发的判断。除此之外，在一项关于先天性巨痣和黑素瘤的表达谱研究中，研究者发现Sox10的表达明显升高，可以作为转录因子参与调控神经嵴干细胞向黑素细胞的分化。而当降低细胞内Sox10的表达，可以有效抑制黑素瘤的形成。

蕈样肉芽肿（mycosis fungoides，MF）是皮肤T细胞淋巴瘤最主要的临床类型。多种基因（原癌基因和抑癌基因）表达异常被认为与MF发病相关。分离、鉴定这些基因对于理解MF发生发展的分子生物学机制具有非常重要的意义。已有研究应用Meta分析比较目前已发表的与MF相关的基因表达谱数据，发现718个基因在MF组织内明显高表达。其中，除已发现与T细胞增生相关的基因外，该研究发现GTSF1和TRIP13基因在MF患者中的异常升高，而NF-κB抑制因子（NFKBIZ）则明显低表达，从而促进NF-κB途径活化，导致肿瘤T细胞异常增生。此外，研究者们通过基因芯片还证实STAT4、CXCR3、BIRC3、TOX、PDCD1、BCL2L14等在MF中存在差异表达，并且初步显示TOX基因异常表达可以作为早期诊断MF的分子标记。

在微小RNA（MicroRNA，miRNA）和长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）方面，肿瘤细胞在转录后水平上的失调控，也被认为是造成肿瘤细胞基因异常表达的主要原因之一。miRNA是一类长约20～24个核苷酸的小分子非编码RNA。它们可以直接与靶基因mRNA的3’UTR区互补结合，降低特定基因的表达，从而参与细胞的增殖、分化、凋亡以及死亡等过程。在这一调控过程中，如果某一个或者某几个miRNA出现明显的异常表达，且这种变化并不能被机体充分代偿，会造成调控的靶基因失平衡，而导致多种病理状态的产生。在皮肤肿瘤中，已有研究借助miRNA芯片发现miR-137在黑素瘤细胞中差异表达，其可以调控转录因子MITF，而后者是黑素细胞发育过程中重要调节者。另外，miR-221/222也被认为是黑素瘤重要的原癌基因，其在肿瘤细胞中高表达，可以抑制CDKN1B和c-KIT受体，加速黑素瘤的增生和分化。其次，LncRNA也是一类具有调控功能的非编码RNA，其长度超过200nt。它们不具备开放阅读框，不能编码蛋白，却可以以RNA的形式在表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等多种层面上调控基因的表达。最近，它们在皮肤肿瘤中的作用也逐渐被研究者们所关注。Leucci等人通过大规模的筛查发现lncRNA基因SAMMSON在人类黑素瘤中特异性地表达，并在大约10%的病例中复制或扩增，但在正常黑素细胞中却不表达。该研究还发现SAMMSON的特异性表达是由转录因子SOX10所激活，而当采用反义核酸技术阻断SAMMSON，可以显著减少黑素瘤的生长。除了SAMMSON，还有一些lncRNA包括BANCR、ANRIL、HOTAIR和SPRY4-IT1也被认为与黑素瘤的生长相关，它们的发现也为未来黑素瘤早期诊断与预后治疗拓展了新的方向。

二、抗皮肤肿瘤药物的筛选

如前所述，尽管黑素瘤的恶性程度高，但其发生基因突变的位点较为集中，因此这就为开发有针对性的抗肿瘤药物创造条件。RAS/BRAF/MEK/ERK丝裂原活化蛋白酶途径是黑素瘤发生、发展的关键调节分子，BRAF蛋白位于MAPK信号途径的入口，因此，BRAF突变必然导致异常信号级联放大。BRAF突变是黑素瘤较为常见遗传变异，发生率约占总病例数的50%。而该位点涉及的众多信号分子，是人为实施干预的良好靶点，因此MAPK信号传导途径已成为药物研究的热点。最近，两种BRAF的抑制剂，维罗菲尼和达拉菲尼在治疗BRAF V600E突变的黑素瘤都显示出50%～60%的反应率，同时使患者获得更长的无进展生存期。两者均通过竞争性结合ATP，与突变型的BRAF有更高的亲和力。同时，两者均对非BRAF V600E患者无明显疗效，因此治疗早期的肿瘤突变检测，对选择化疗药物至关重要。目前针对该位点的筛查，主要通过传统的Sanger测序和Taqman探针技术。两方法操作简便、价格低廉，有利于大范围筛查。但它们均对突变发生的频率要求较高，对于早期病变或异质性较强的肿瘤组织缺少足够的准确性。

除此之外，BRAF-MAPK信号传导通路是人类黑素瘤细胞免疫逃避所必需的，MEK抑制剂可以增加黑素瘤细胞抗原表达，有利于肿瘤的治疗。目前已经开发出以BRAF为特异靶点的抑制剂如多美吉。吡嗪酰胺也可作为微量的BRAF抑制剂，但是在黑素瘤模型中这种抑制是可逆的，只针对这一单一信号途径的治疗措施易产生耐受。不过，关于MAPK途径外的研究已经给黑素瘤的治疗提供了新的思路。此外，Grbovic等研究发现BRAF V600E的稳定需要HSP90分子伴侣，在HSP90抑制剂作用下BRAF V600E更易降解。这些成果都说明黑素瘤的发生与多种因素有关，其治疗除干预MAPK途径外，还有很多其他方面措施可以采取。

除了BRAF基因突变，在一些非BRAF基因突变的患者中也存在其他高频的基因变异，如KIT基因的L576P或K624E以及NRAS基因变异。目前针对这两个突变基因，临床上也已开发了有针对性的药物。2013年NCCN治疗指南首次将治疗胃肠道间质瘤和白血病的KIT抑制剂甲磺酸伊马替尼用于转移性黑素瘤的治疗，发现该药物对带有KIT外显子11或者13的突变者有明显疗效。而针对NRAS，临床上已开发出一些小干扰RNA，可以抑制黑色素瘤细胞的增殖，并提高化疗的敏感性。替吡法尼作为脂肪酸转移酵素抑制剂，可以通过阻断RAS翻译后修饰的关键步骤而抑制RAS的激活。

综上所述，肿瘤的产生是一个复杂的过程，涉及细胞周期、细胞凋亡、DNA修复等多个病理生理学过程。针对以上变化，研究者需要根据不同的研究目的选择合适的分子生物学方法。而随着科技的进步，皮肤肿瘤研究不断有新的方法涌现，其中包括：用于基因功能研究的siRNA、CRISPR-Cas9；细胞发育相关的单细胞检测技术；以及新的单分子DNA检测技术。这些技术的出现，不仅有助于我们对基因功能更加深刻的认识，也为未来肿瘤的发病机制研究以及新的靶向治疗创造条件。