第三节 神经遗传病的基因诊断
神经系统正常功能的发挥依赖于细胞内成千上万种基因及其产物的精确表达与调控。基因水平变异、基因组水平变异、染色体水平变异等均能导致不同类型的神经遗传病。神经遗传病的临床表现多样且十分复杂，最终确诊往往依赖于基因诊断。
根据神经遗传病致病基因或致病突变是否明确可将基因诊断分为间接基因诊断和直接基因诊断。
间接基因诊断：在致病基因未知或致病基因已知但其突变未知时，通过对患者及其家系成员进行连锁分析（linkage analysis）或单倍型分析（haplotype analysis），推断受检者是否带有致病基因或突变的诊断方法。
直接基因诊断：对受检者直接进行染色体、已知致病基因或候选基因的序列及结构进行突变检测的诊断方法。
基因诊断可分为细胞水平诊断和分子水平诊断。细胞水平诊断指基于细胞遗传学的染色体核型分析（chromosome karyo-type analysis）和荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）等技术，主要用于神经系统染色体病或基因组病的基因诊断。分子水平诊断指基于分子遗传学的连锁分析、单倍型分析、分子杂交、聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）及其衍生技术、基因芯片及新一代测序技术等，主要用于神经系统单基因病、基因组病或染色体病的基因诊断。
（一）神经系统染色体病或基因组病的基因诊断
染色体病是由染色体数量或结构异常所致的疾病，往往涉及基因组较大范围片段，可影响多个基因的表达，其临床表现复杂；神经系统染色体病则往往表现为发育异常、智力发育障碍及癫痫等。传统的染色体病诊断方法主要基于细胞遗传学，包括染色体核型分析、荧光原位杂交（FISH）等。染色体核型分析需结合特殊染色、光学显微镜识别和检测大于5Mb的染色体片段结构异常，主要用于检测亲代染色体平衡异位导致子代大范围CNV产生的情况，是临床上进行产前诊断染色体异常的金标准，且具有准确性高、经济实惠等优点。
染色体核型分析现在基本已经被染色体微阵列分析（chromosomal microarray analysis，CMA）替代，如染色体阵列比较基因组杂交（array-based comparative genomic hybridization，array-CGH）技术和基于高密度单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）微阵列（SNP-array）芯片技术，这两种方法被广泛用于全基因组水平的CNV分析。相较于染色体核型分析，CMA具有更高的分辨率，不仅可以有效检测常规核型分析的染色体不平衡变异，还可以检测整个基因组的微缺失/微重复，适用于基因组病的基因诊断。
FISH方法是用荧光标记的核酸探针与染色体进行原位分子杂交，以鉴别待检核酸片段在染色体上的相对位置或数目是否发生异常改变，优点是可直接检测未经细胞培养的标本，可避免污染并缩短检测时间，其衍生的多色荧光原位杂交技术不仅增加了可检测染色体的范围，并可识别染色体微小易位和多条染色体间复杂易位，同时可以确定标记染色体的来源，主要用于产前诊断和发现染色体异常后的进一步验证。
（二）神经系统单基因病基因诊断
神经系统单基因病通常由某个基因发生某种突变而致病，并在家族中以一定的方式遗传。神经系统疾病中有多种类型单基因病，如遗传性周围神经病、遗传性肌病、遗传性共济失调、遗传性癫痫及遗传性运动障碍疾病等。这些疾病的基因突变方式多种多样，包括SNV、indel、复杂重排突变（complex rearrangement）、CNV、STR等形式。根据疾病特点及基因突变形式选择合理的基因诊断方法是神经遗传病专家需要考虑的问题。
1.基于连锁分析定位克隆致病基因
通过家系调查和系谱分析确定为神经遗传病，且致病基因未明或排除已知致病基因等前提下，应用遗传标记进行基因分型、连锁分析或单倍型分析，以定位单基因病的致病基因，最后通过候选基因法鉴定致病基因及致病变异。第一代遗传标记为限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP），第二代遗传标记为微卫星标记，第三代遗传标记为单核苷酸多态性（SNP），以后两种常用。目前已知的大部分单基因病的致病基因及部分多基因病的易感基因均通过这一策略获得克隆。尽管这种方法耗时费力，但它在过去的20余年中发挥了重要作用；随着测序技术的发展，近年来基于SNP分型芯片的连锁分析，结合NGS等技术，大大加快了神经遗传病致病基因的鉴定与克隆。
2.基于分子杂交技术进行基因诊断
互补DNA单链能够在一定条件下结合成双链，即所谓的分子杂交。早期的基因诊断主要采用分子杂交技术，包括用于DNA变异分析的Southern印迹杂交（Southern blotting）技术，用于已知基因、已知突变检测的等位基因特异的寡核苷酸杂交（allele-specific oligonucleotide，ASO）技术等。上文所述的FISH、array-CGH等技术也属于分子杂交技术。
3.基于PCR相关技术进行基因诊断
PCR技术是一种灵敏的分子诊断技术，主要用于基因已知序列的检测。早期的PCR相关基因诊断方法包括PCR结合限制性内切酶片段长度多态性分析法、PCR结合单链构型多态性分析法等，主要用于检测点突变，这些检测方法在早期神经遗传病的基因诊断中发挥了重要的作用，但这些方法只能筛查有无突变，不能准确获知突变的具体碱基改变，且费时费力，目前较少使用。
近年来发展起来的PCR结合变性高效液相色谱（denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC）分析法及PCR结合毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE）分析方法，虽然也不能准确获知突变的具体碱基改变，但其具有通量高、自动化、灵敏度高等优点，适合大样本的已知突变的筛查，使用更广。而实时荧光定量PCR（realtime quantitative PCR，RT-PCR）、多重PCR（multiplex PCR）及多重连接探针扩增（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）等是近些年发展起来的PCR衍生技术，是目前基于PCR相关技术的主流基因诊断方法。
（1）PCR结合变性高效液相色谱（PCR-DHPLC）技术：
通过在部分变性的温度条件下，变异型和野生型PCR产物具有不同的分离柱保留时间识别变异，可进行基因突变检测及SNP分析等的研究，具有高通量、自动化、灵敏度高、适用性广及经济等优点，适合大样本已知突变的筛查；但其只能提供个体样本有无突变信息，无法得出具体的突变类型。
（2）PCR结合毛细管电泳（PCR-CE）技术：
PCR-CE是一类新型液相分离技术，可简便、稳定、经济地鉴别不同片段PCR产物，是微卫星遗传标记、多核苷酸重复扩展突变的检测方法，在SCA相关亚型等的基因检测中广泛应用。
（3）实时荧光定量PCR（RT-PCR）技术：
利用荧光信号累积，实现实时监测整个PCR进程并对起始模板进行定量分析的方法，具有特异性好、灵敏度高、自动化程度高等优点。在神经遗传病基因诊断方面，既能在基因组水平鉴定或验证CNV，也能在RNA水平进行基因表达差异分析。
（4）多重PCR技术：
在普通PCR的基础上加以改进，可扩增多个目的片段的PCR技术，具有节省时间、降低成本、节省样本及提高效率的优点。多重PCR技术在脊髓性肌萎缩（spinal muscular atrophy，SMA）的SMN1基因突变、DMD/BMD的DMD基因突变等检测中广泛应用。
（5）多重连接探针扩增（MLPA）技术：
是近年发展起来的DNA相对定量技术，可同时检测多种DNA或RNA拷贝数变化，具有操作简便、成本低廉、应用领域广等特点，在神经遗传病基因诊断中发挥重要作用。MLPA对CNV的检测比多重PCR更可靠、快捷。
（6）重复引物PCR技术（repeat-primed PCR，RPPCR）：
也称为三引物PCR法，应用三种特异引物进行PCR扩增，结合荧光毛细管电泳检测扩增产物，适用于特殊、超大片段多核苷酸重复扩展突变的检测，如强直性肌营养不良（myotonic dystrophy，DM）、弗里德赖希共济失调（Friedreich ataxia，FRDA）等。
（7）富含GC片段PCR（GC-rich PCR）技术：
通过对传统PCR的改进，使富含GC的DNA模板进行PCR扩增时效率提高。该技术在富含GC的多核苷酸重复片段扩增中得到广泛运用，如神经元核内包涵体病（neuronal intranuclear inclusion disease，NIID）的NOTCH2NLC基因，额颞叶痴呆（frontotemporal dementia，FTD）或肌萎缩侧索硬化（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）的C9orf72基因等。
（8）长片段PCR（long range PCR，LR-PCR）技术：
是一种扩增长度能够达到5kb以上的DNA片段的PCR，可用于大片段CNV的检测等，在五核苷酸重复扩增突变检测中得到广泛运用，如家族性皮质肌阵挛性震颤伴癫痫（familial cortical myoclonic tremor with epilepsy，FCMTE）的SAMD12基因等。
4.基于基因芯片技术进行基因诊断
生物芯片是基于高密度的、固定在固相支持介质上的生物信息分子（如寡核苷酸、gDNA片段、cDNA片段或多肽片段、蛋白质）微阵列。基因芯片是生物芯片的一种，具有高通量、多样化、自动化、反应微型化等特点，在基因突变检测方面有广阔的应用前景。通过设计不同的探针阵列可以使该技术具有不同的应用价值，如用于突变检测的array-CGH、SNP-array和各种神经遗传病特异性基因芯片（基因panel）等，用于基因多态分析的SNP-array等，用于基因表达谱测定的表达谱芯片等。
5.基于测序技术的方法或策略进行基因诊断
测序技术发展历经数代，最经典的Sanger测序技术也称第一代测序技术，其准确率最高，适合单个基因的检测，而进行多个基因甚至全基因组检测时显得费时费力且不经济。NGS采用大规模平行测序方法，具有通量高、速度快及单碱基测序成本低的优势，普遍用于临床及研究领域，但也存在测序盲区及测序错误等缺陷。TGS进一步弥补了NGS的缺陷，已开始用于神经遗传病的基因诊断。
（1）NGS：
基于NGS的方法主要有WES、TRS及WGS技术，它们各有特点，运用时要有所选择。
1）WES：
是通过对个体基因组的全部编码基因外显子进行序列测定，寻找影响编码蛋白功能变异位点的高通量测序技术。WES具有高效、高通量等优点，适用于单基因病致病变异鉴定的第一步筛查，如SNV或indel。
2）TRS：
在深度测序基础上，准确筛查目标基因组区间的SNV及indel等变异形式，根据测序覆盖深度等差异来判断外显子重排变异（exon rearrangement variant，ERV）。通过定制捕获芯片，对目标基因组区间进行超高深度测序，可以对某一致病基因定位区间内编码基因、某一高度遗传异质性疾病已知致病基因或某一表型相关致病基因，形成基因panel进行大范围检测。
3）WGS：
WGS不仅包含基因组编码序列，还补充了UTR区、内含子区及基因间区的非编码序列，可更全面地对遗传变异进行检测。WGS不仅可以检出SNV及indel等变异形式，还能检出ERV、CNV变异形式。因此，WGS对变异的检出率高于WES，可以检测出WES遗漏的致病变异，提高了基因诊断率。
（2）TGS：
TGS弥补了二代测序的主要缺陷，即存在DNA重复元件（repetitive element）、SV等测序盲区及文库构建过程因PCR引入的潜在测序错误等。TGS对检测重复序列或复杂SV具有明显优势。TGS用于临床基因诊断还需要精准质量、降低成本。
（唐北沙 曾 胜）