第二节　研究思路与方法

一、研究思路

（一）体内过程导向的中药活性成分作用机制研究

现代社会慢性复杂性疾病发病率逐年上升，传统的基于单基因、单靶点的药物筛选和研发模式有着一定的局限性。中药天然产物有着悠久的临床应用基础，在防治慢性、复杂性疾病方面体现出显著优势，以中药活性成分为模板/来源的药物发现策略已成为新药研发的重要途径。然而，该领域也面临诸多挑战，其中的关键问题是体内物质基础及作用机制的阐明。当前药物研发决策体系中简单地将传统化学药物研发模式直接应用于基于中药活性成分的药物开发，尚未建立符合复杂组分中药自身特点的研究思路和体系。

目前较多活性良好中药活性成分的开发前景因为药动学性质不理想而受到质疑，造成这一现象的重要原因是当前药物研发决策体系中忽视了化学药物研发与基于中药活性成分的药物研发存在重要区别。化学药物的作用靶标已知，但是疗效及安全性有待临床验证；与此相反的是，很多中药的疗效/安全性在长期的临床应用实践中已被普遍认可，但是靶标及物质基础尚不明确。化学药物的开发过程是基于已知靶标评价候选药物ADME特性是否合适，其中涉及的单成分、单靶点的药代动力学、药效动力学评价技术体系显然不适用于多成分、多靶点药物评价。《中国中医药创新发展规划纲要（2006—2020年）》中明确指出建立符合中药自身特点的研究、评价方法和标准规范体系是当前中药现代化研究的主要任务之一。

中药在体内的转运、分布、代谢的处置规律与其药效的产生密切相关。在前期中药体内过程的研究中，我们发现中药有效成分通常在生物体内发生广泛代谢，发挥药效作用的主要是其活性代谢产物，典型代表如人参皂苷Rg₃，在肠道菌群作用下代谢生成人参皂苷Rh₂和PPD发挥系统效应；此外，还有许多中药有效成分如人参皂苷、小檗碱等，口服生物利用度低，血药浓度极低，大部分不能够在心、脑等病灶器官有效分布，但是可以调节器官病理网络中的关键分子通路或内源性信号分子传递，通过整体、间接调节作用从而对病灶部位产生远程、多途径调控的作用。

由此可见，中药有效成分的药代动力学特征有着其自身的特殊性，存在药代动力学与药效动力学的表观矛盾，提示其体内过程与药效机制之间存在着不同于传统化学药物的关联模式。事实上，传统化学药物的研发关注药物对作用靶标的直接作用，是从先导化合物开始的药代动力学、药效动力学不断优选和临床验证模式；而中药的疗效和安全性有着临床应用基础，其物质基础和作用确靶标/机制需要深入阐明，传统化学单体药物开发中对生物利用度等PK特性的要求并不适用于该类天然产物活性成分。基于以上背景和思考，我们提出了“反向药代动力学（reverse pharmacokinetics）”的研究理念［14］（图4-1）。该研究思想的核心在于提出中药活性成分的药代动力学研究并非评价候选化合物分子的吸收、分布、代谢、排泄（ADME）特性是否理想，而是从确切的临床药效指标出发，在全面阐明活性成分体内过程特性的基础上，结合特定的疾病发病机制和生物学规律，深入探讨活性成分群可能作用的多部位与多环节，从而揭示中药等天然产物的物质基础和作用机制，推动临床转化和新药开发，为创新药物的研发提供新策略和新分子。

许多天然活性成分（如白藜芦醇、姜黄素、小檗碱）具有确切的药理活性，然而口服生物利用度低等药动学性质使得其作用机制不明，应用于新药开发的前景受到质疑。基于“反向药代动力学”理论，基于中药活性成分的药物研发核心是根据疗效，通过药物代谢和药代动力学（DMPK）特性的不同揭示潜在作用物质基础及靶部位/靶标/机制的过程，从而从新的视角认识天然化合物药效学作用和药动学性质之间的不对应现象。因此，生物利用度差等药动学特征不应成为限制该类天然化合物开发成新药的障碍，而应当以天然化合物的体内处置规律为导向，寻找其作用靶部位/组织/靶分子，进而优化体外药效模型，提高体内外研究的相关性，从而有效阐明其作用靶标，提高新药发现的成功率与准确率。在前期的中药药代动力学研究实践中已建立的中药体内外复杂组群定性定量与关联网络分析、多组分药代动力学研究等共性关键技术，为深入揭示中药主要组分群的体内外转运、代谢途径、处置规律、暴露特征提供了重要技术支撑，对于中药药动/药效/机制研究具有重要推动作用。“反向药代动力学”理论已成功应用于研究小檗碱、白芍总苷等活性成分的药效机制研究［15-18］。

（二）代谢信号分子调控与中药整体作用机制研究

代谢是生物体摄取能量、维持机体稳态的重要途径，对于生命化学活动的正常进行及适应内外环境的变化具有重要意义。根据所代谢的物质不同，代谢分为糖代谢、脂质代谢、氨基酸代谢、核苷酸代谢等类型。传统的观点主要认为代谢物是基因和蛋白功能的下游产物。近年来，研究者认识到代谢物谱的变化不仅反映基因、蛋白功能与生化过程，代谢过程中的中间产物或终产物还可通过与基因组和蛋白组的相互作用，参与众多信号传递过程的调控并影响细胞的功能及命运，在宏观层面调节器官对话及生理病理过程。目前，围绕代谢调控的生理病理机制研究已成为国内外研究的前沿热点，为揭示肿瘤、糖尿病、冠心病、抑郁症等多种疾病的药物新靶标及干预策略提供了新思路。

单一通路研究难以诠释中药多靶标作用特点和中药“整体调节”的治疗思想。代谢组学可以定量描述生物内源性代谢物质的整体及其对内因和外因变化应答规律，在药物作用机制研究方面具有广泛用途，有助于从多方面、多角度探索中药作用机制，对于推动中医药现代化意义重大。目前代谢组学技术已广泛应用于中药的作用机制研究，系列研究表明中药可通过调节疾病状态下失衡的代谢网络发挥整体疗效，并可针对疾病状态或药物干预后的代谢谱变化开展生物标志物研究。然而，大多数研究仍停留在组学数据聚类分析和描述的层面，研究结果缺乏特异性，某些共性、高丰度代谢产物的升高或降低与疾病发生发展及药效的关联性不强，因果关联性研究极少，难以得出确证性结论。基于以上现象，本课题组提出在阐明内源活性信号分子代谢调控规律与信号传递机制的基础上，开展基于代谢信号分子调控的中药活性成分药代-药效关联研究；同时，利用活性中药成分作为“探针”，发现参与疾病发展及转归的关键代谢性信号分子。

基于代谢信号调控理论，研究表明人参皂苷口服吸收差，但可能通过调节外周炎症反应与色氨酸代谢产生远程抗抑郁效应［3，19］。基于前期人参皂苷通过调控外周犬尿氨酸代谢转运发挥“远程效应”的发现，阐明外周犬尿氨酸（kynurenine，Kyn）对炎症单核细胞的激活作用是影响小鼠抑郁行为的重要机制，发现Kyn在连接色氨酸代谢与抑郁症炎症免疫信号调节中的重要作用，并且提示调控Kyn/AhR信号轴在抑郁症治疗中的潜在作用，对于揭示皂苷类中药活性成分的脑保护机制及基于代谢调控的抗抑郁药物研发具有一定启示意义［20］。此外，通过对活性中药代谢调控机制的解析，发现系列信号代谢分子的新功能与新机制：发现Kyn的代谢产物犬尿喹啉酸（kynurenic acid，KA）对NLRP3炎症小体活化具有显著的调节作用，可诱导自噬依赖的NLRP3蛋白降解，参与到其抑制炎症小体活化的作用，揭示了KA作为内源性NLRP3炎症小体活化调节分子的新功能，并为精神应激加重肠炎提供了新发现［21］；基于水飞蓟宾/甘草酸调控NASH、生脉方/人参皂苷抗动脉粥样硬化的药效研究，发现胆汁酸及其受体FXR在调控炎症、细胞死亡中具有复杂的调控网络与机制；进一步基于炎症、感染模型揭示了胆汁酸是一类内源性NLRP3激活剂，并发现胆汁淤积加重感染性休克的分子机制［22］。

（三）中药“体内三维药效物质基础”理论与方法学研究

中药药效物质基础是指中药对某疾病产生治疗作用的全部药效成分的总和。传统的中药物质基础研究理论主要基于血清药物化学和血清药理学，认为中药有效成分必须以血液为载体输送到靶点从而产生药效作用，血清中含有的成分才是中药在体内直接发挥作用的物质，因而应用分离血清作用于体外模型进行药效评价及谱效关系研究［23］。以上理论及方法在中药药效物质基础研究方面取得了一定的成果，揭示了部分中药化学成分发挥药效的作用机制，但是药效的评价侧重于血液及特定病灶部位或某个药效指标，一定程度上脱离了中医整体观的理论，难以全面和准确阐明中药药效物质基础。

现代生物学中不断揭示的器官对话机制与中医学的整体观理念相辅相成，为阐明中药的作用机制带来了新的启示。在中药的药代动力学研究中，发现虽然某些成分由于生物利用度低、代谢消除迅速等原因难以在体内达到有效浓度，但可能通过调控内源性信号分子及器官相互作用而产生间接的、远程的调节效应，共同参与到中药的整体调节效应中。因此，中药发挥药效作用的物质基础不仅包括在生物体内具有适宜动力学特征的原型成分组及活性代谢物组，还包括吸收差但可在肠道部位发挥“远程调节” 作用的活性成分。为了更好地阐明中药体内“多成分、多靶位、多环节”的协同整合作用，需要从中药体内过程特征出发，重视中药在体内多种器官中痕量/微量“非靶向”成分定性定量分析，关注弱吸收或难以吸收中药成分的协同作用，探索其可能经由肠道菌群、代谢、免疫调节系统，通过内源性活性小分子及分泌蛋白发挥临床功效。

基于以上思考和研究实践，课题组在“反向药代动力学” 理论基础上提出中药“体内三维药效物质基础”的研究思想：中药在生物体内不同时间段、不同组织器官/细胞内具有不同成分组成，通过对不同组织器官的整合调节作用发挥药效，因而体内药效物质基础是多器官/细胞中直接作用与间接作用活性成分的综合。该理论强调以药代动力学为基础的药效学评价，在分析正常和模型状态下体内多组织成分动态组成基础上，从疾病的网络病理机制及中医药理论出发，通过多个细胞模型及整体动物验证实验，结合成分敲出/组合给药的形式，阐明药效物质基础及作用机制，对阐明中药体内“多成分、多靶位、多环节”的协同整合作用具有重要意义。该理论方法已应用在生脉方、银杏叶滴丸等中药制剂的物质基础研究中［10］。在揭示其体内过程的基础上，本课题组从肠道菌-肠道免疫系统互作、神经-免疫互动调控、肠-肝代谢调控等角度揭示其中活性物质组的药效作用新模式，以内源性活性物质代谢调控为切入点，全面揭示其保护心脑器官的药效物质组，对于研究中药复杂成分药效作用靶标和物质基础具有启示意义。

（四）中药“多向代谢”及其药效桥接研究理论与方法学研究

中药通过原型成分及其代谢产物共同起效已成为共识，但目前对于中药代谢的认识还较局限，大多是沿用化学药物经典代谢理论和技术进行中药的代谢研究，对中药代谢产物的解析方法还限于经典的Ⅰ相和Ⅱ相代谢产物研究的经典方法，中药代谢与活性、特别是中药整体疗效的关联研究极少，诸多理论和技术难题亟待突破。中药成分群易在肠道菌群及各种代谢酶的作用下，生成复杂多样的代谢产物；活性代谢产物是中药发挥整体药效作用的重要体内物质基础。在前期大量中药成分代谢研究中发现，中药代谢除了经典的Ⅰ相和Ⅱ相代谢反应外，还有两个显著不同于化学药物的代谢特征：一是由于中药成分群同系化合物的特点，通过水解、降解等代谢途径，断键后成为另一中药原型成分，如人参皂苷Rg₃通过脱糖代谢后生成Rh₂，中药这种代谢途径并不产生新的物质，但会导致中药成分构成比的显著变化，从而可能对药效产生显著影响［4］；二是部分中药成分在肠道菌群的作用下，经过充分代谢后，可能生成内源性的代谢中间体，如单糖、短链脂肪酸、对羟基肉桂酸等，这些物质作为代谢中间体被生物体利用，从而可能导致生物体功能的改变，发挥药效作用［6］。

基于长期的研究实践，结合文献分析，本课题组提出中药“多向代谢”（polymetabolism）的新理论，指出中药复杂成分代谢具有不同于化学药物的代谢特点，包括质变代谢、量变代谢和内化代谢三种反应类型。①质变代谢：即经典Ⅰ/Ⅱ相代谢，经由经典的Ⅰ相、Ⅱ相代谢反应，产生新的物质，包括羟化、甲基化、葡糖醛酸化等产物；②量变代谢：中药同系成分群发生水解、降解等代谢反应，不产生新的物质，但改变了原中药同系成分群各成分的构成比；③内化代谢：经多步生物转化最终代谢成为人体内源性代谢中间体，整合到人体代谢过程中发挥药效作用。中药的这三类代谢反应，均可能通过不同的方式对其整体药效作用产生显著影响，包括产生新的活性代谢产物、改变有效成分构成比和整合调控生物体内源代谢网络三种方式。建立中药化学物质组及代谢产物组定性定量表征、复杂代谢产物分离制备、活性筛选与评价、多成分网络PK-PD等共性关键技术，从代谢物与机体神经-内分泌-免疫系统互作规律出发开展机制研究，深入阐明中药这三类代谢途径与整体药效作用的关系，有望突破中药体内药效物质基础研究的传统模式，丰富其多成分、多靶点作用特点的内涵与机制（图4-2）。

二、研究技术

由于生物体信号与代谢网络、中药成分组成与体内代谢转化、中药代谢与机体代谢交互影响、代谢网络与信号网络的交互调控等多重、多维复杂性，中药多成分-多靶点的调控机制研究仍存在诸多共性的关键技术难题。针对以上问题，中国药科大学郝海平团队课题组在中药体内外复杂组分分析技术及多组学联合平台方面进行了不断的探索与改进。

（一）中药化学物质组及代谢产物组定性定量表征技术研究

中药成分构成复杂、代谢多样/广泛，内源代谢物干扰广泛等多个复杂因素的交互重叠，这使得中药“多向代谢”研究存在诸多关键技术难题，成为药效关联研究的瓶颈。在前期建立中药药代动力学研究技术体系基础上，发展与构建了中药“多向代谢” -药效桥接关键技术体系。

1.中药经典代谢产物的定性定量表征技术

（1）特征诊断离子延伸结合Stepped MSAll策略：

基于经典Ⅰ相、Ⅱ相代谢物多具有与原药相同的母核结构因而在MS/MS谱图中产生对应于母核结构的“特征诊断离子”，针对不同组群的特征诊断离子，开发出一种非偏向性的数据采集模式——Stepped MSAll技术［24］。该方法通过优化MS/MS条件的设置，最大限度地提高同系成分群特征诊断离子的检出率，有利于快速诊断代谢物的组群归属，有效解决中药复杂代谢物质组结构难断的问题。

（2）前体离子/中性丢失扫描触发检测（PIDAI/NLDAI）及鉴定策略：

传统的中药化学物质组-代谢物质组的鉴定均通过信息依赖采集法（information dependent acquisition，IDA）提供的高质量MS/MS图谱完成，然而该方法存在对高丰度成分的偏向性，易于错失低丰度活性物质的信息采集。PIDAI/NLDAI技术依赖于QTRAP仪器高灵敏度的前体离子/中性丢失扫描（precursor ion scanning/neutral loss scanning，PIS/NLS）检测模式，由同类成分的特征诊断离子的阳性响应触发IDA模式做全谱碎片离子扫描，通过整合PIS/NLS提供的特征诊断离子及IDA扫描所得的分子量和二级全谱碎片等多维信息，实现中药原药成分及其低丰度代谢物的检测及归属。

（3）基于肠黏膜成分谱的入血成分靶向解析策略：

很多中药先经过胃肠道或肠道菌群发生代谢，其代谢产物在肠黏膜中的浓度要高于血液循环系统中，更容易被检测到。因此，采用通过对肠黏膜中的样品进行全面鉴定后，根据肠黏膜中的指示信息，利用灵敏度更高的多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）模式，对血浆样品进行检测，从而将非靶向性的代谢物发现转化为靶向性的鉴定的研究思路，应用于银杏叶提取物大鼠给药后体内微量成分的检测，提高了检测的灵敏度与准确度［6］。

2.量变代谢产物解析技术

在前期表征出中药复杂化学物质组的基础上，通过对多个原药成分同时定量能完成对量变代谢产物的解析。对可获得标准品的原型成分及代谢物，基于UPLC-Q-TOF和UPLC-QTRAP等高分辨、高灵敏度仪器，建立同步、快速定量复杂中药体系中原型成分群、体内代谢物群的MRM方法，定量跟踪分析量变代谢物之间的体内转化及动态过程，为多组分整体药代动力学研究奠定分析基础。获得高纯度的原药标准品往往成为分析量变代谢物的瓶颈。因此，建立以下不依赖于标准品的关键技术，以期解决量变代谢物解析中的问题：

（1）基于化合物结构-离子强度关系策略的同系化合物定量法：

针对同系化合物中难以获得标准品的成分，依据同系组群中可获得标准品的物质，以同系成分的内在理化性质及溶剂组成为自变量，以离子强度为因变量，建立化合物结构-离子强度关系（quantitative structure and ionization intensity relationship，QSIIR）的多元线性回归模型。基于该模型，结合经典的MRM方法对中药中同系化合物群中无法获得标准品的物质在复杂基质中的含量进行绝对定量，该方法已在脉络宁注射液的成分鉴定中应用［25］。

（2）SMART定量技术快速筛选量变代谢物：

SMART（Stepped MSAllRelied Transition）定量技术是利用四级杆-时间离子阱（Q-TOF）高质量分辨率和高速的优势，在Stepped MSAll模式下使生物样品中的原型药成分逐级断裂，选择对应于原型成分的特征碎片离子，并确定相应最优碰撞能量，完成不依赖于标准品的MRM监测对象及参数的确定。基于优化后的MRM参数，在三重四级杆上分析给药后不同时间点的生物样本中原型成分的响应的变化比值，快速筛选含量发生显著变化的原型成分，即经生物转化后产生的量变代谢物［26］。

（3）不依赖标准品的非同系类化合物的相对暴露定量法：

基于SMART策略初步确定含量发生显著变化的量变代谢物后，以提取物作为标准品，通过“稀释比标准曲线法” 对血药浓度进行校正，血药浓度用相当于提取物中的成分量来表征。进一步基于“相对暴露法”，对中药中原型成分在复杂生物基质样本中的相对暴露程度等药代动力学参数进行计算。

3.内化代谢物的解析技术

对于经肠道菌群代谢为内源性代谢中间体的“内化” 代谢产物，可以利用代谢组学技术，以LC-MS/MS为手段，结合代谢组学数据库检索出中药给药后含量显著增加的差异化合物，作为内化代谢产物的候选化合物；再基于原型成分的母核结构对应的特征碎片离子，筛选出对应于不同原型成分（组群）的内化代谢产物。由于内化代谢产物既可能来自给药后机体自身的代谢调节响应，也可能由外源的中药成分内化代谢产生，因此对原型成分进行同位素标记，基于高分辨质谱分析含未标记及标记化合物给药的生物样本，比较候选化合物的精确分子量的偏移及对应的MS/MS图谱，快速筛选出与原型药相关的内化代谢物及其代谢中间体，明确其代谢途径。

（二）多组学联用技术平台与药物靶标发现技术体系

基因组学、蛋白质组学及代谢组学等系统生物学技术的发展和引入为多组分多靶点中药的整体药效评价与机制研究带来了重要动力。基于代谢组学与其他相关学科的交叉结合研究，将为解析中医药防治慢性、多基因复杂性疾病的作用特点与机制研究开拓新的视野。

为提高差异代谢物的检出率，郝海平研究团队分别建立与优化了针对内源活性小分子的靶向及非靶向代谢组分析技术。其中，针对色氨酸、胆汁酸、神经递质靶向代谢组学分析技术［27］，可实现对小鼠模型及临床样本中内源活性物质组的高通量分析；针对某些含量及丰度较低的内源性活性物质组，例如脂质组，建立一种高灵敏度及高特异性的检测方法，对生物样本中单甘油酯进行快速准确的定性及定量检测，该方法成功应用于各类细胞裂解液中单甘油酯的快速准确定性分析［28］。针对现有代谢物组化合物库的局限性，利用同一特定类别的化合物通常结构上具有一定的关联性因而可以通过代谢反应追踪的特点，建立基于代谢通路延伸策略（metabolic pathway extension approach，MPEA）的内源性代谢物预测技术：通过各代谢反应将各代谢物关联成网络，对网络中的各代谢物逐层进行鉴定，实现不依赖于标准品数据库的候选代谢物结构快速推导，解决了目前代谢组学研究中无法鉴定数据库未收录的代谢物的瓶颈问题，为全面发现与评价中药对内源代谢通路的调控机制提供新策略［29］。同时，优化非靶标物质组的检测与鉴定参数，提高代谢物分析灵敏度与准确度［30］。

在代谢组学平台建设基础上，同步建立蛋白质组学技术体系，用于药物活性成分及内源性活性分子的靶标发现研究。基于多组学整合研究，获得潜在的中药药效靶标，针对配体-靶标互作筛选研究中往往会产生较高的非特异性结合影响筛选的问题，所建立的原态-变性转换离子源质谱，可以用于检测及筛选基于非共价键形成的配体-蛋白复合物，鉴别与蛋白产生特异性结合的天然药物分子，同时获取其亲和力及解离常数等信息，明确各个配体与靶蛋白之间的结合亲和力及明确其作用是否具有特异性［31-32］。所开发的基于乙醛标记联合原态质谱MRM的配体-蛋白互作分析技术，为发现复杂细胞基质中的药物潜在互作分子提供新方法［33］。

（三）中药代谢产物分离、制备与合成关键技术

1.“垂钓”与“敲除”方法分类收集活性代谢物

基于免疫亲和色谱技术的活性成分筛选，利用活性代谢物与目标蛋白或组织的特异性结合，有效“垂钓”活性代谢物，主要包括：①制备活性代谢物“捕获”色谱系统，如细胞膜色谱。②活性代谢物在线检测系统，结合二维色谱技术和高分辨质谱技术，确证目标物分子组成。③在线柱切换系统收集活性代谢物。活性代谢物“敲除” ：①制备液相系统收集指纹图谱中活性代谢物色谱峰。②重复富集敲除活性代谢物，色谱峰馏分进行分段浓缩纯化。③建立敲除活性代谢物色谱峰馏分分析方法，提高痕量成分检测灵敏度。

2.中药代谢产物的分离纯化

（1）中药代谢产物信息的采集与整合：

联用LC-MS与PDA检测模式，分析所收集的给药后生物样本，完成对各代谢产物液相部分的保留时间、质谱信息和紫外全扫描吸收谱数据的关联整合分析，对应确定各代谢物相对保留时间、质谱信息及紫外吸收特性。可根据同系化合物群选择对应最优吸收波长，并运用于制备液相的检测波长的确定。

（2）制备液相分离纯化目标代谢产物：

运用制备液相技术，根据不同代谢产物的紫外吸收特性，对不同时间段洗脱的或有较强响应的峰进行馏分收集。采用质谱对不同馏分进行初步判断，去除纯度较低、组分较杂的馏分，保留与药源性代谢产物质谱数据相对应的、较纯的馏分，并采用旋蒸浓缩、冻干和真空干燥等技术联用的方法获得制备样品粉末。

3.代谢产物的生物合成制备技术

（1）Ⅰ/Ⅱ相代谢体系：

选取不同种属来源的肝微粒体，将其制备成肝微粒体温孵液，加入小型发酵容器中。将足量原型药物加入微粒体溶液中与之共孵育。收集反应产物，对目标代谢物进行分离提纯。取提纯后的目标代谢物进行质谱鉴定，将质谱结果作为质控和纯度鉴定指标。

（2）S9代谢体系：

制备大鼠肝脏及肠道S9于小型发酵罐中，投放足量的原药，启动反应。收集反应产物，对于目标代谢物进行分离提纯。对提纯后的目标代谢物进行质谱鉴定，将质谱结果作为质控和纯度鉴定指标。

（3）肠道菌群代谢体系：

取回盲瓣中内容物，接种到特定培养基中，在厌氧条件使其生长至临界浓度。根据发酵罐体积加入足量的原药材，启动反应。待代谢产物量基本足够后，加入有机溶剂终止反应。通过一系列手段将目标代谢产物分离提纯。取少量提纯后的代谢产物，制备成可进样的溶液并加入LC-MS/MS中进行定性检测，作为代谢产物的鉴定和质控指标。

（四）代谢产物活性评价及其与整体药效桥接研究技术

1.活性代谢产物的筛选

建立原代细胞系（神经元、心肌细胞、T细胞、巨噬细胞等）、细胞株（血管内皮细胞、肝细胞、肠细胞、单核巨噬细胞等）或三维器官（类器官、球体肿瘤模型等）体系。根据病理网络特征及中药作用理论，以体内组织、细胞分布特征为导向，在各类体外药效模型中评价各类型代谢产物的生物活性；建立谱效分析的多变量回归、神经网络模型等数据处理方法，构建代谢物成分谱与药效的关联网络，通过“代谢谱-效” 关系分析，预测主要代谢途径和相应产物的药效作用特点，为后续确证性研究提供参考依据。

2.药效确证与关联研究技术

根据前述“代谢谱-效”关系的研究结果，综合考虑疾病网络关键节点，优选对免疫调节、细胞保护、组织功能调节等重要环节具有潜在生物活性的代谢产物群，包括Ⅰ、Ⅱ相代谢产物，量变代谢产物，内化代谢产物，进行相应在体生物活性的确证性研究，探索代谢物的体内协同调节效应；通过基于机制的药动/药效桥接研究，在整体动物模型、体外细胞水平、分子水平确证药效作用机制和潜在药物作用靶标，探讨各类代谢产物的药效作用特点，最终揭示各类代谢产物变化对中药疗效的影响。