第三节　研究思路及方法应用实例

一、基于犬尿氨酸代谢调控的人参皂苷的脑保护远程作用机制研究

人参是传统中药的代表，临床广泛用于多种疾病的预防和治疗，如糖尿病、动脉粥样硬化、阿尔茨海默病、脑卒中、抑郁症。现代药理学研究发现，人参皂苷是人参的主要活性物质群，是人参对中枢神经系统、内分泌系统和免疫系统调节效应的物质基础。有关人参皂苷的药代动力学研究结果表明：人参皂苷类物质大多生物利用度较低，在脑内几乎没有分布。这种在靶器官低分布的药代动力学特征与人参皂苷的中枢神经保护药效之间形成了矛盾。这种药动学与药效学不相关的现象也提示，目前从脑内局部寻找人参皂苷的作用靶点或者解释人参皂苷作用机制的模式存在着一定的局限性。

人体是一个有机的整体，各器官和组织之间通过精密的相互作用共同维持机体内环境的稳态。近年来的研究指出：神经系统与免疫系统之间的相互作用参与到中枢神经系统的发育和功能等生理过程，而神经免疫系统互动的紊乱也是参与中枢神经系统疾病发生、发展的重要因素。这一生物学机制提示应当以一种整体的观点来研究中枢神经系统疾病的病理机制并寻找治疗策略。

基于人参皂苷的药代动力学-药效学矛盾现象和神经免疫互动的生物学机制，郝海平研究团队提出人参皂苷可能是通过一种间接机制发挥其中枢神经保护作用，而神经免疫互动的机制可能是人参皂苷的这一间接作用模式的生物学基础。在此假设的基础上，以人参皂苷Rg₁为代表性人参皂苷类物质，研究中枢炎症状态下人参皂苷Rg₁的药动学特征及其对神经免疫互动信号的干预方式，并在此基础上探讨人参皂苷Rg₁的作用机制以及初步论证中枢炎症疾病的治疗新策略。

（一）中枢炎症状态下人参皂苷Rg₁的药代动力学研究

基于前期建立的人参皂苷类成分LC-MS/MS定量方法（定量的下限达到10ng/ml，且线性关系良好），对小鼠腹腔注射Rg₁（20mg/kg）后生物样本中人参皂苷Rg₁及其代谢物Rh₁进行同步定量。结果表明，正常小鼠与脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）模型小鼠血液中Rg₁的峰值约在250nmol/L左右，并随着时间逐渐降低。在8小时和12小时，血液中Rg₁浓度维持在50nmol/L左右，提示LPS诱导的中枢炎症并未明显影响Rg₁在血液中的经时变化过程。进一步考察正常组及模型组小鼠脑内Rg₁的动态分布，结果表明：Rg₁在正常小鼠及模型组小鼠脑内的分布峰浓度仅在1.5～3.5nmol/L范围，且在给药2.5小时以后基本无法测得Rg₁在脑内的分布。与此相比，Rg₁在肝脏的分布相对较高，并且中枢炎症模型小鼠中未观察到明显的肝脏分布的改变。Rg₁在脾分布浓度较低，然而LPS诱导的炎症模型小鼠脾中的Rg₁浓度相对与正常小鼠中的浓度有所增加。以上的实验结果表明，中枢的炎症激活状态并未显著增加Rg₁在脑内的分布，并且Rg₁仍主要分布在机体外周，从而初步排除了Rg₁在脑内发挥直接的脑保护作用的可能性。此外，对血液及脑组织中的Rh₁浓度测定结果表明：腹腔注射Rg₁后其活性代谢产物Rh₁并没有在中枢和外周血液有效分布，因此排除了Rg₁的代谢物介导其中枢调节活性的可能性。

（二）人参皂苷Rg₁干预神经炎症损伤作用研究

侧脑室注射LPS 24小时后，可以明显观察到小鼠体重的减轻（12.19%±0.78%），而假手术组却未见明显改变（1.98%±0.62%）。经典的行为学实验结果进一步表明，模型小鼠表现出明显的抑郁样行为，如对糖水偏好的显著缺失，强迫游泳和悬尾实验中不动时间的延长。Rg₁给药小鼠体重减轻程度较模型组减少（9.89%±0.54%，P＜0.05），糖水偏好及强迫游泳的不动时间指标均有显著改善（P＜0.05），悬尾实验中的不动时间有所减少，但未到达统计学的差异。以上实验结果初步确证了Rg₁对于原发于中枢的炎症所诱导的抑郁样行为具有明显的改善作用。苏木精-伊红染色（HE染色）结果表明，单独给予LPS后可以明显观察到细胞核着色的减弱以及形态的异常，反映出神经元的皱缩与死亡。而给予Rg₁后，出现皱缩或死亡的神经元明显减少，表明Rg₁对于LPS诱导的神经损伤有一定的保护作用。此外，Iba-1免疫组化实验结果表明：LPS刺激后可以显著诱导小胶质细胞的活化，小胶质细胞形态同时发生明显改变，反映其高度活化的状态；而Rg₁给药组的小鼠皮质中Iba-1阳性细胞数减少，同时细胞形态学上未观察到明显的肿胀，表明小胶质细胞活化程度的减弱。

（三）基于色氨酸代谢调节的人参皂苷Rg₁脑保护机制研究

对LPS诱导的抑郁样行为小鼠脑部色氨酸-犬尿氨酸代谢紊乱情况进行考察，结果表明：中枢注射LPS后，可以引起色氨酸代谢通路的显著改变，表现为5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）向5-羟吲哚乙酸（5-hydroxyindoleaceticacid，5-HIAA）的代谢转化增加，同时犬尿喹啉酸（kynurenic acid，KA）与3-羟基犬尿氨酸（3-hydroxykynurenine，3-HK）的比例减少，提示犬尿氨酸（kynurenine，Kyn）通路在中枢炎症作用下转向神经毒性物质的生成。在给予Rg₁的小鼠中可以明显观察到：5-HT与5-HIAA的比例及KA与3-HK的比例均趋向正常水平，证明Rg₁可以有效干预中枢色氨酸-犬尿氨酸的代谢紊乱，促进其向神经保护方向转化。中枢给予LPS后，血浆中的犬尿氨酸代谢通路产生了明显的动态变化，表现为Kyn、3-HK及KA生成的增加，提示中枢炎症导致了外周吲哚胺-2，3-双加氧酶（indoleamine-2，3-dioxygenase，IDO）的活化并进一步激活了犬尿氨酸向下游的代谢。在给予Rg₁的小鼠血浆中，可以观察到中枢给予LPS组KA及3-HK的生成有所降低，且在24小时时显著降低（P＜0.05），而Rg₁可以提高KA的水平，说明Rg₁可以促进炎症状态下外周血液Kyn向KA的方向转化。

前期发现的Rg₁分布于外周却可以有效抑制中枢促炎介质表达以及小胶质细胞过度活化的现象，提示Rg₁对外周免疫细胞的中枢浸润情况可能会有调节作用。流式细胞术结果表明Rg₁可以选择性地抑制外周Ly6Chi单核细胞的中枢浸润，而对于中性粒细胞和CD4+T细胞的浸润没有明显影响。Rg₁对外周的选择性调节也提示Ly6Chi单核细胞可能是介导Rg₁抗神经炎症及脑保护作用的靶细胞。以此为切入点，进一步研究发现外周Kyn可通过激活芳香烃受体（aryl hydrocarbon receptor，AhR）信号而增强单核细胞的趋化能力与促炎作用，表现为Ly6Chi单核细胞中枢浸润的增加与胶质细胞活化的增强。通过药物调节AhR信号或者耗竭外周单核细胞，可以阻断抑郁小鼠模型中Kyn的作用。以上研究结果共同提示，Kyn是一种具有免疫调节作用的信号分子，通过在中枢-外周的传递而介导了神经免疫互动的信号环路；人参皂苷通过干预外周Kyn的代谢而发挥间接的神经免疫调节作用，为理解其脑保护的“药动-药效”关联机制提供新思路。

二、基于脂质代谢调控的水飞蓟宾保肝作用机制研究

水飞蓟来源于菊科药用植物大蓟Silybum marianum（L.）Gaertn.的果实和种子，用来治疗肝胆疾病已有两千多年的历史。水飞蓟宾是其主要活性成分，具有确切的保肝作用，对病毒性肝炎、脂肪肝、肝纤维化、初期肝硬化、肝中毒等肝脏疾病均具有显著的治疗作用。国内以水飞蓟宾为主要成分的成品药物有水飞蓟宾胶囊、水飞蓟宾片、水飞蓟宾葡甲胺片等。水飞蓟宾在国内外临床应用广泛，有研究显示水飞蓟宾是西方发达国家最受欢迎的10种天然产物之一。然而目前对水飞蓟宾保肝作用机制的研究尚处于起步阶段，对其保肝机制的认识仅局限于抗炎、抗氧化作用，具体的作用机制和分子靶标尚不明确。

（一）水飞蓟宾明显改善小鼠非酒精性脂肪肝炎

课题组前期对水飞蓟宾改善非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）的机制和作用靶标进行探索。首先通过连续8周给予小鼠胆碱缺乏（methionine and choline deficient，MCD）饮食来复制NASH模型，同时在第6周起灌胃给予高低剂量的水飞蓟宾。造模结束后处死小鼠并收集血清和肝脏，通过多个指标来考察水飞蓟宾对MCD引起的NASH的保护作用。水飞蓟宾可显著降低MCD引起的肝指数升高及血清谷丙转氨酶（GPT）、谷草转氨酶（GOT）水平；肝脏切片病理分析结果显示，MCD饮食引起肝小叶内大量的脂肪空泡、肝细胞气球样变、大量肝细胞变性坏死，且有大量的炎症细胞灶性浸润，肝脏纤维化蛋白α-SMA表达上调，TUNEL阳染细胞增多，水飞蓟宾给药可显著减少脂肪空泡，缓解肝纤维化程度和凋亡程度，使肝小叶结构和肝细胞形态有不同程度的恢复。MCD组小鼠肝脏中IL-1β、IL-6及TNF-α的mRNA水平均显著上调，水飞蓟宾可以剂量依赖性地降低上述炎症因子水平。以上结果表明，水飞蓟宾对MCD引起的小鼠NASH具有确切的保护作用。

（二）水飞蓟宾直接调控NASH小鼠肝脏脂质代谢与转运异常

药代动力学研究表明，水飞蓟宾长期灌胃后水飞蓟宾在血浆中的暴露量极低，仅第一个时间点（1小时）的浓度高于定量下限（2ng/ml），其余时间点的血浆浓度监测不到。与此相比，肝脏中的暴露量相对较高，1小时的浓度约为300ng/g和200ng/g肝组织，4小时后浓度低于50ng/g肝组织。该结果支持水飞蓟宾可以直接作用于肝脏发挥调节作用。基于NASH的“二次打击”假说，研究从肝脏脂质代谢调控角度探讨水飞蓟宾的药效机制。代谢组学研究表明，水飞蓟宾对MCD饮食引起的各脂质和胆汁酸成分改变具有显著的纠正作用。参与脂质和胆汁酸代谢的相关基因表达分析结果显示，MCD饮食引起的小鼠NASH状态，小鼠肝脏中负责脂肪酸摄取的Fatp2、Fatp5和L-fabp的表达显著下调，参与脂肪酸合成的Fasn、Accα、Gpat、Dgat1和Dgat2的mRNA水平均显著上调，参与脂肪水解的Hsl和Atgl的mRNA水平显著升高，参与β氧化的Lcad、Mcad、Cpt1、Acat1、Hmgcl和Hmgcs的表达没有显著变化，Ucp-2、Acox-1及Cyp4a14的表达上调；参与胆固醇向胆汁酸代谢转化的限速酶Cyp7a1表达显著上调，负责胆汁酸摄取的转运体Ntcp表达显著下调，胆管侧转运体Bsep和Mrp2表达显著下调，基底侧转运体Mrp4和Ostβ表达显著上调，Ost没有显著变化，而水飞蓟宾对上述转运体表达异常均有显著的恢复作用。通过对上述脂质和胆汁酸代谢的调节，水飞蓟宾显著纠正NASH状态下的脂代谢紊乱，并最终治疗和缓解NASH。以上研究证实，通过对肝脏脂质代谢和转运的综合作用，水飞蓟宾直接作用于肝脏部位改善NASH疗效。

三、基于肠道菌群代谢调控的银杏叶滴丸抗卒中及机制研究

在全球范围内，脑卒中是人类第三大疾病致死因素，同时也是引起患者身体长期残疾或认知障碍的重要原因。脑卒中可分为两种：一种是脑血管堵塞引起的称为“缺血性卒中” ；另一种是脑血管破裂引起的称为“出血性卒中”。其中前者占80%，后者占20%。以银杏提取物为原料制成的各种制剂，自20世纪90年代起，一直是治疗脑血管疾病的首选药。例如银杏内酯注射液，是一种由银杏二萜内酯提取物组成的标准制剂，临床上用于脑梗死再感染的神经保护治疗。本课题组在前期揭示银杏叶滴丸体内外复杂物质组及活性成分体内动力学特征的基础上，探索其抗缺血性脑卒中的药理作用机制。

（一）银杏叶滴丸抗脑卒中药效活性验证

建立最常见的局灶性缺血模型——大脑中动脉闭塞模型（middle cerebral artery occlusion，MCAO），验证银杏叶滴丸对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用，并对其神经以及肠黏膜形态和屏障功能的保护作用的可能机制进行探讨。脑缺血再灌注24小时后，假手术组（Sham）大鼠均没有异常行为，神经行为学评分为0；模型组（MCAO）大鼠神经行为学评分显著升高，评分值为3.12分±0.29分，出现较为严重的神经行为功能缺失，具体表现为向缺血侧倾倒或转圈；银杏叶滴丸预给药组神经行为学评分明显降低，且评分降低程度与剂量高低呈正相关（低剂量组评分值为1.87分±0.29分，高剂量组评分值为0.71分±0.15分），表明银杏叶滴丸能够明显改善大鼠脑缺血再灌注损伤神经损伤症状。2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色结果显示，Sham组的脑组织经染色后呈均匀一致的红色，而MCAO组栓塞侧脑半球肿胀、苍白、无光泽，其梗死面积占49.15%±6.67%；与MCAO组相比，银杏叶滴丸给药后可以显著缩小梗死范围（低剂量组梗死面积占29.60%±5.56%，高剂量组梗死面积占20.40%±2.07%），梗死主要区域缩小至皮质。此外，HE染色后可见Sham组皮质细胞结构正常，形态呈锥体或圆形，神经细胞密集且分布均匀；MCAO组缺血侧神经细胞周围间隙增宽，胞体肿胀，胞内有空泡，胞核呈现不规整形态；低剂量组梗死区神经细胞较MCAO组轻度水肿，正常与坏死细胞相间存在；高剂量组缺血坏死程度轻于低剂量组，细胞饱满，形态接近假手术组，表明高剂量组明显减轻缺血再灌注造成的脑损伤。

再灌注24小时后检测各组大鼠脑缺血侧的炎症细胞因子及趋化因子表达水平发现，与Sham组相比，MCAO组大鼠脑损伤侧的炎症因子（除IL-17外）和趋化因子均显著增加。趋化因子Cxcl2和Ccl2增加的数量级最大，呈现出几百倍的变化量。与MCAO组相比，银杏叶滴丸高剂量给药组TNF-α、IL-10、IL-17、Cxcl1、Cxcl2、Ccl3、Ccl5明显降低，但较假手术组水平仍有升高。

（二）银杏叶滴丸对大鼠肠屏障的作用研究

Sham组回肠黏膜结构完整，排列整齐，细长紧密；MCAO组部分绒毛融合、长度缩短，顶端部分破损或断裂，肠壁明显变薄，部分肠绒毛脱落和固有层分离；银杏叶低剂量组肠上皮细胞坏死较少，部分绒毛断裂，排列不连续；高剂量组较MCAO组情况明显得到改善，绒毛连续性好，提示银杏叶滴丸可明显缓解大鼠脑缺血导致的肠黏膜组织学及形态学损伤。MCAO造模后血浆中肠道通透性指示剂FITC-Dextran的荧光信号有增加趋势，但不具有显著性差异，而银杏叶滴丸可使血浆中的FITC-Dextran恢复到正常水平。

D-乳酸（D-lactic acid，D-LA）和LPS均是反映肠道屏障功能的敏感评价指标。当肠黏膜受损时，肠道通透性升高，肠道细菌产生的D-LA和LPS释放入血，致使二者在血液中的含量上升。与Sham组相比，MCAO组大鼠血浆中D-LA浓度升高了151.3%，LPS升高了153.3%。经过剂量为300mg/kg的银杏叶滴丸预处理后，D-LA浓度比MCAO组降低了24.9%，LPS下降了17.0%。综上可见，脑卒中状态下伴有肠道屏障的破坏，具体表现为肠道绒毛融合、长度缩短，顶端部分破损或断裂，肠壁明显变薄，部分肠绒毛脱落和固有层分离，且肠道紧密连接蛋白表达水平显著降低，使肠腔中的各类物质更易经肝门静脉进入体循环；银杏叶滴丸经口服途径给药后可以显著改善肠道屏障的完整性，恢复紧密连接蛋白的表达，降低肠腔中LPS等物质经肝门静脉血进入体循环的含量。

（三）银杏叶滴丸对肠道菌群短链脂肪酸水平的调控作用

肠道微生物群发酵膳食纤维的主要产物是短链脂肪酸（short-chain fatty acid，SCFA）。短链脂肪酸主要包括乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐等，是具有神经活性的微生物代谢物。SCFA主要是碳水化合物经肠道菌群发酵产生，而后被肠道吸收进入血液循环并随血流进入各组织。首先考察了各组大鼠肠道内容物（回盲瓣和结肠内容物）、血浆以及脑损伤侧SCFA的含量。回盲瓣内容物中，MCAO组丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸含量显著增加；银杏叶滴丸给药可减少增加幅度，恢复到Sham组水平。结肠内容物中，MCAO组甲酸、乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、己酸、乳酸含量均显著增加；银杏叶滴丸给药可减少增加幅度，恢复到Sham组水平。体外Caco-2细胞实验表明，高剂量丙酸钠（50mmol/L）作用下，闭合蛋白（occludin）显著减少；丁酸钠在5mmol/L浓度下可显著减少密封蛋白-1（claudin-1）的表达，在高剂量20mmol/L下显著减少闭合蛋白表达。因此，在缺血性脑卒中的情况下，肠道中包括丙酸、丁酸等SCFA的浓度显著升高，高浓度丙酸、丁酸可以显著下调紧密连接蛋白的表达；而银杏叶滴丸可以显著降低肠道中多种SCFA的浓度，进而恢复紧密连接蛋白的表达，阻断炎症因子向脑区的聚集，保护脑组织。以上结果表明，调控MCAO后的肠道菌群SCFA代谢从而保护肠道屏障功能的完整性可能是银杏叶提取物改善脑卒中的重要原因。